Estufa de cultivo para microbiología

 

Siguiendo con el tema microscopía, es probable que alguien este interesado en ver bacterias y  será necesario hacer algún cultivo, esto requiere de una estufa que mantenga la temperatura en 37ºC bien, ese es el objetivo de este proyecto

Mas adelante pondré una serie de cuidados que hay que tener cuando se trabaja con microorganismos

Hace unos días un compañero de trabajo me regaló un microondas que se había quemado y como sabe que soy de los “juntamugre”… la cuestión es que pensaba usar el transformador para una soldadora de puntos y me quedaba el gabinete que esta en muy buenas condiciones y las resistencias del grill que también están en perfecto estado y así empecé este proyecto, queriendo usar esto, pero antes de desguazarlo probé un magnetrón que tenía tirado en el taller y oh! sorpresa salió andando, así que quedará para experimentos múltiples como microondas, todo esto lo digo porque seguramente muchos tendrán algún gabinete de este tipo y viene fenómeno para el proyecto.

Tengo un par de amigos de alto conocimiento en electrónica Ángel y Héctor y les pedí que me diseñaran alguna electrónica de un termostato para ponerle, asi cada uno diseño uno, el de Ángel es bastante sencillo lleva un par de integrados y los indicadores son led y Hector un proyecto mas ambicioso con una PIC y un display digital con lectura directa de temperatura este circuito estará proximamente en el blog para los mas entendidos en electrónica

Como no tenía ahora el gabinete del microondas improvisé uno con una conservadora de vacunas que tienen un tamaño aproximado de 35x50x35 cm en el interior como resistencia calefactora un foco de filamentos de 40W El termostato que usé para esta estufa es el de Ángel, al mas elaborado lo dejé para modificar la estufa de cultivos del laboratorio que tiene un termostato mecánico muy viejo, pero como ya dije también podrán encontrarlo a la brevedad en el blog

En la foto se ve el conjunto, la conservadora de vacunas que se ve iluminada en su interior por el foco, el termostato y el tester con la termocupla controlando la temperatura, es sorprendentemente estable.

Tratar de que el foco no toque las paredes de la conservadora para que no se queme

Este simple circuito lleva como sonda una con cuatro diodos comunes 1N4148 la que debe estar dentro delrecinto de la estufa así como también el foco de 40W o la resistencia que se use, la electrónica del termostato va en una caja plástica con los led a la vista y el potenciómetro que regula la temperatura, he agregado una llave de corte general me queda hacerle un cuadrante marcado con las temperaturas a que corta, este simple dispositivo es muy adecuado para incubadoras, asi que los criadores de aves podrán servirse del mismo. Si el recinto de la estufa es bastante grande muy bien puede servir un secador de cabellos como calefactor, que resulta muy adecuado por tener el ventilador que homogeiniza la temperatura .

El circuito

Gracias Ángel por todas las molestias que te tomaste en el diseño, el pcb, la lista de materiales y demás

La distribución de los componentes

El pcb

Vista previa

Lista de materiales y otros archivos con el PCB a medida aqui

Mas fotos del que he construido

Los cuatro leds, el de la izquierda marca el equipo encendido, los dos centrales indican si estan encendidos ambos que la temperatura esta en rango, si solo el rojo esta prendido esta pasado de temperatura y si solo el verde, le falta temperatura, el último led verde de la derecha indica que el calefactor esta encendido. La salida inmediatamente al costado del último led va a la resistencia calefactora, el cable gris es el de la sonda con los 4 dioditos.

Aca se ve el interior de la caja, el trafo es uno de 12+12 500 mA de la línea LQH (lo que había) igual los dos transistores que usé no son los del diagrama también de esta famosa línea LQH

Primera prueba

En una cápsula de petri con agar nutritivo, apoyé mi dedo sobre la superficie del medio y dejé en estufa durante 12 horas

La capsula recién sembrada con la contaminación de mi dedo

Se pueden ver una buena cantidad de colonias distintas, algunas han alcanzado bastante tamaño, otras mas chiquitas.

Micrótomo de hechura casera para el aficionado a la microscopía

Hace algún tiempo lo tenía pensado, pero como no tenía el torno no podía avanzar en el proyecto.
Se trata de hacerlo con algo ya hecho, un micrómetro, en argentina los made in Taiwan valen $56 es decir U$A 15 una cifra que permite el proyecto, por otro lado fabricándolo del modo propuesto el instrumento de medida queda utilizable con solo sacarle la pieza torneada, claro que sería mucho mejor sacarle el arco donde va el yunque, mas cómodo.
Estos aparatos de medida tienen una resolución de 10 micrones,cada vez que se gira completo el manguito son 0,5 mm y esta graduado de a 0,01mm, creo que para un micrótomo manual es bastante aceptable,  el problema se presenta en la cuchilla que debe ser muy buena

Aca van unas fotos para que vean como esta construido

Puede verse el micrómetro comercial y la pieza torneada en aluminio

Tiene tres prisioneros que ajustan en la parte cilíndrica, soy bastante novato con el torno y las roscas partieron el aluminio así que están arregladas con un poco de POXIPOL
 
La pieza montada en su sitio

La parte plana donde se desliza la navaja de barbero debe estar pulida a espejo, lo óptimo sería pegar sobre la misma un vidrio con una perforación del tamaño adecuado, el tornillo lateral sirve para comprimir los tacos de parafina que contienen incluida la muestra

 

La inclusión en parafina consiste en hacer un bloque con la consistencia adecuada para los cortes del tejido que nos interesa observar, en general los tejidos son blandos, imaginen un trozo de hígado que se mueve como un flan, sería imposible cortar una tajada bien finita como para ver al micro, entonces se deshidrata el tejido con alcohol cada vez mas concentrado y luego se sumerge en xileno o tolueno (ojo con el tolueno que si lo aspiran pueden quedarse drogados) este proceso hace que el tejido se ponga miscible con la parafina, hecho esto se hace un taco de parafina con el tejido dentro y recién luego se procede a cortarlo.

Estos son órganos de pollo, están en formol al 10% para fijar, pueden disecar una rata y guardar sus órganos en formol al 10% a los pulmones conviene inflarlos desde la tráquea con la misma solución valiéndose de una jeringa

El corazón de un pollo

En esta imagen pueden verse los tubos con alcohol a distintos porcentajes hasta llegar al alcohol absoluto, en este caso estoy preparando un tallo vegetal a ver que sale, el frasco de boca ancha a la derecha  tiene el xileno, el tiempo en cada tubo es de 15 minutos y en el xileno igual

Luego del xileno la muestra se pasa a parafina que se ha calentado hasta que este bien líquida, ojo cuando largan el tejido al tubo porque se producen proyecciones de parafina el xileno es muy volátil y se evapora, el tejido en el interior burbujea, se deja una media hora en la parafina caliente (para que se mantenga asi puse el tubo sobre un foco encendido
 
Transcurrido el tiempo se preparan los tacos, con una tira de papel rodeando alguna tapa que entre mas o menos justo en el receptáculo del micrótomo

Se acomoda el tejido en el receptáculo y se llena con parafina fundida

Luego se recorta el taco en forma de pirámide truca y se lo pone al micrótomo (obviamente cuando esta la parafina bien dura, conviene dejarlo en freezer una hora)
Puse una moneda en el fondo del receptáculo para que empuje parejo el vástago del micrómetro.

En esta última imagen hay un taco con un trozo de corazón del que saque algunas muestras.

Importante es la navaja, este tipo que se muestra en la imagen se adapta muy bien consiguiendo cortes bastante delgados de unos 30 micrones

 
El video del corte

Puede haber errores de técnica solo soy aficionado a esto y solo cuento lo que he he probado

Por el momento no he logrado una buena coloración de los cortes de tejidos animales, pero salen lo suficiente delgados para poder ver por el microscopio, agrego a continuación unas fotos de tallos vegetales sin coloración previa donde se distinguen claramente los tejidos que lo forman

Mitosis en células meristemáticas primarias de raíz de cebolla

Las células meristemáticas son células que se encuentran en los vegetales y que tienen la facultad de dividirse, hay dos tipos las primarias y las secundarias, las primarias hacen crecer al vegetal en longitud, están en las yemas y en las puntas de las raíces y las secundarias hacen crecer al vegetal en grosor, están después del segundo año en troncos de vegetales.
Estuve trabajando para poder visualizar células en estado de mitosis que es una de las formas que tienen las células para dividirse, en raíces de cebolla.
He conseguido algunas imágenes interesantes que pongo aquí, solo que he tenido que colorear con hematoxilina eosina que es un tipo de coloración medio complicada, estoy tratando de teñir con giemsa solo que las apetencias tintoriales de las células inmaduras son distintas a las de células diferenciadas y salen oscuras, ya probaré mas y pondré técnicas bien accesibles. Por ahora para que se entusiasmen algunas fotos.

Se colocan tres palillos clavados en la cebolla, en la parte ecuatorial de la misma y se sumerge en agua en un recipiente, al cavo de unos 4 días tendrán las raicillas como se muestran

 
La cebolla con sus raíces, algunas sin sus puntas que  utilicé para los preparados

 
Lo que les decía de las apetencias tintoriales las mas diferenciadas tiene el citoplasma mucho mas claro

 

Si buscan en google podrán reconocer en que fase de la mitosis se ajusta

 

 

 

Las fases

He conseguido ver estas mitosis usando coloración de hematoxilina eosina, la técnica es la siguiente:

Se consiguen  7 frascos de unos 250 cc donde pondremos los colorantes y otros líquidos necesarios,

Frasco 1 Hematoxilina liquida hasta la mitad

Frasco 2 Agua

Frasco 3 Eosina hasta la mitad

Frasco 4 Agua

Frasco 5 Alcohol de 98 º

Frasco 6 Alcohol absoluto 100º

Frasco 7 Xilol

Los colorantes no se tiran sirven para hacer muchas coloraciones.

Como preparar las muestras y teñir

Se cortan los ápices de las raicillas (unos 2 mm) y se los colocan en una solución de  acido acético al 45%, se calienta hasta ebullición, se deja enfriar y se repite la operación. De esta manera las raicillas se ponen bastante transparentes
Seguidamente colocamos el material sobre un porta, en el extremo del mismo y hacemos un scquash (igual que para los cromosomas gigantes), esto es colocar sobre el material un cubreobjetos y envolver con servilleta de papel luego apoyar en porta sobre una superficie plana y con el pulgar hacer presión sobre el lugar donde esta el cubre, presionar lo mas que se pueda para que se disgregue el material, hecho esto se despega el cubre con cuidado tratando que quede la mayor parte del material en el porta, con el cubre que siempre queda con material se puede volver a realizar la operación en el porta un poco mas arriba de donde la hicimos la primera vez
Se deja secar al aire y se procede a teñir

10 minutos en frasco numero 1

5 minutos en frasco 2

5 minutos en frasco 3

Enjuagar el preparado en el frasco 4 cambiando dos o 3 veces el agua

2 minutos en frasco 5

2 minutos en frasco 6

5 minutos en frasco 7

Dejar secar al aire y para la observación se coloca una gota de vacelina líquida sobre la muestra extendiendola bien. Se observa  con lente panorámica de 10X y luego con 40x cuando localizamos una imagen mitótica

Se puede teñir tambien con orceína en forma directa colocando 1 gota de orceína sobre las raicillas dejando unos 10 minutos y luego haciendo el squash, yo no dispongo ese colorante asi que lo dicho anteriormente lo he leído. También según alguien comentó con solución de lugol o tintura de yodo pueden verse, tampoco tengo experiencia al respecto, hay que probar.

Cromosomas gigantes en Drosophila spp

Agradecimiento: A la Doctora Beatriz Goni de la facultad de Ciencias de la Universidad de la Republica (Uruguay), ella ha colaborado con el trabajo  con todo desinterés y ha hecho que sea posible.

Introducción

Se conocen dos tipos de cromosomas de gran tamaño, los politénicos y los plumulados, la característica es su enorme tamaño de unas 1000 veces más que los cromosomas somáticos, la longitud va desde las 1200 a 2000 μ y su diámetro entre las 4 y 5 μ.

Para encontrar a estos cromosomas vamos a tener que conseguir larvas de una mosquita muy difundida en todo el mundo, la Drosophila, es la mosquita de la fruta

Estas larvas en sus glándulas salivales tienen cromosomas gigantes politénicos.

Esta es la mosquita, probablemente Drosophila simulans que es mas frecuente que melanogaster sin embargo a los efectos de ver los cromosomas gigantes  hay pocas variaciones

Esta mosquita es muy frecuente verla cuando dejamos a la sombra algún cesto con frutas, inmediatamente estas están merodeando y revoloteando sobre ellas, son muy pequeñitas comparadas con las moscas comunes y en general tienen los ojos rojos. La hembra es más grande que el macho.

Esta mosca desde 1909 luego de un trabajo de Thomas Morgan pasó a ser el insecto mas usado en genética experimental debido a su económica reproducción, rápida descendencia y amplia distribución en todo el mundo.

Como conseguir las larvas

Medio de cultivo

Para ver los cromosomas gigantes necesitamos larvas, las cuales  cultivaremos en un medio casero que podemos preparar así:

1 banana o plátano

1 cucharada grande de levadura de cerveza

1,5 cucharada grandes de Maicena o fécula

1 cucharada de yogur natural

1,5 cucharada de vinagre de alcohol

½ taza de agua caliente.

Se colocan todos los ingredientes haciendo una papilla, luego se le agrega a la misma la media taza de agua bien caliente, se mezcla y se reparte en potes de unos 10 cm de diámetro, el líquido debe alcanzar 1,5 a 2 cm en el pote.

Antes de colocar la mezcla en el pote conviene hervir la papilla antes que leude la levadura.

Si se va a trabajar en cruzamientos genéticos conviene agregarle al medio de cultivo algún conservante como por ejemplo el Nipagin, de esa manera se puede guardar en heladera el medio listo para usar, en este caso solo usé la mezcla sin hervir y sin este conservante , nada mas que los ingredientes que están al principio

Se ve el aspecto del medio y también algunas mosquitas que detectaron el aroma y están en las paredes del recipiente

Después de dos días el recipiente tenía una buena cantidad de moscas por lo que lo tapé para que otras moscas de otro tipo no colonicen allí

Hay otros medios de cultivos, pero este funciona bien y los ingredientes los tenemos en casa

El ciclo de la mosca a unos 25 º C es de unos 10 días, de huevo pasa a larva de larva a pupa y de pupa a adulto, más o menos a partir de los 6 o 7 días veremos el movimiento de las larvas que suben por las paredes del pote.

Increíble movimiento de las larvas en el el medio a los 6 días (un mar de gusanos)

Disecando las larvas

La larva tiene unos 3 mm de largo a los 6 días que es el momento de separarlas para disecarlas (Por favor ecologistas no joder con eso que soy cruel y mato animalitos, son gusanos...)

Se colocan en una capsula de petri o un vidrio de reloj con unas gotas de acido acético al 45% para que no se deshidraten, con un fondo oscuro.

Ojo no confundir las pupas que son de un color pardo y no tienen movimiento

Para disecarlas necesitamos dos agujas (usé dos de extracción 25/8 con unos manguitos plásticos que las hacen mas manejables) Es conveniente ayudarse con una lupa, en mi caso usé una tipo monóculo de relojero

Las agujas  aplastarlas para que el material no se vaya dentro, deben tener buena punta pero no filosas.

Se coloca una aguja mas o menos al medio de la larva aplastándola y dejándola inmóvil y la otra en las fauces ( se distinguen bien porque son negras, además la larva se desplaza con esa parte hacia delante) luego se desplazan las agujas en sentido contrario desgarrándola, la parte de la aguja que estaba en las fauces quedará con las glándulas

Las glándulas son de color blanco grisáceo y conviene separarlas perfectamente de la parte de fauces, que queden solas o lo mejor que se pueda, una vez hecho esto las depositamos en un portaobjetos con una gotita acético al 45%

Una larva de 3er grado, son las as grandes y generalmente adheridas a la pared del frasco con el cultivo

El tamaño de la larva comparado con el bisel de una aguja 25/8

La zona donde están las glándulas salivales

Coloración

En los textos donde se describe este práctico recomiendan la orceína láctica, si se dispone de ella hay que poner una gota de colorante sobre el material y dejarlo 10 minutos luego un cubreobjetos, seguidamente se pone una servilleta de papel  sobre el mismo y con el pulgar se presiona fuertemente para disgregar el material (squash). En este tipo de coloración podrá observarse el bandeo de los cromosomas, adjunto una foto que me proporcionó la doctora Goni realizada con esta técnica

Yo no dispongo orceína realicé coloraciones de las que disponía, lo que mejor anduvo fue el colorante de Giemsa, es un líquido con varios colorantes muy conocido y económico, se utiliza en los laboratorios para colorear sangre un litro de este colorante sale aproximadamente unos U$A 20

Técnica con Giemsa

Una vez disecadas las glándulas las colocamos en un porta con unas gotas de ácido acético al 45% hasta que se pongan  transparentes, aproximadamente unos 15 minutos, luego ponemos un cubre sobre el material y con una servilleta de papel sobre el mismo y por debajo hacemos presión fuertemente sobre el cubre con el dedo pulgar sin girar, eso se denomina scuash  y rompe los núcleos de las células dejando los cromosomas bien extendidos, luego colocamos el portaobjetos sobre hielo seco (si disponemos de él) y una vez congelado el material con la punta de una aguja hacemos saltar el cubreobjetos, si no hay hielo seco quedará bastante material pegado al cubre, podemos intentar otro scuash al costado del primero para dejar la mayor cantidad de material.

Se deja secar al aire y se vierten sobre el mismo 10 cm de colorante, preparado con 10 cm de agua y 10 gotas de giemsa se deja actuar el colorante 10 minutos luego se lava con chorro de agua fino sobre un costado del porta para que el agua no arrastre el preparado

Observación

Se coloca una gota de aceite de inmersión y se la desparrama en forma uniforme, siempre aunque se observe con objetivos que no son de inmersión en preparados secos hay que poner el aceite, si no se dispone de ella puede usarse vaselina líquida con buen resultado. La primera observación se hace con objetivo panorámico de X 10 y se localizan los núcleos que quedan de un color rojizo, luego se pasa a X 40 y luego a X100 con inmersión

Núcleo de célula gigante a X 40

 

 

Y ahora lo mas lindo, los cromosomas bien distendidos y en toda su magnitud con el bandeo característico