Electroforesis en acetato de celulosa

Electroforesis en acetato de celulosa (Cellogel)

 

Fundamento teórico

 

Es un método para fraccionar mezclas proteicas, tal como lo es el suero sanguineo, como las moléculas tienen distinta movilidad cuando son sometidas a la acción de un campo eléctrico, separándose en fracciones. El buffer o tampón que se use para la corrida es fundamental, porque de él va a depender la carga neta de las moléculas, de su pH. Otros factores importantes son el tamaño de la molécula, la intensidad de corriente utilizada y la temperatura.

Nota: No es que las proteínas en realidad tengan carga, tienen carga neta cero en su punto isoeléctrico, pero a determinado pH hay grupos ionizables principalmente COO^-  y NH3⁺ que le dan esa carga necesaria para el fraccionamiento.

 

Materiales a utilizar

 

Una fuente de unos 150 DCV 100 mA

Una cuba electroforética (ver foto) esta es comprada, pero puede fabricarse fácilmente con acrílico, son dos compartimentos separados sobre la separación va montado un puente de acrílico también donde se monta el cellogel

Aplicadores o sembradores  El mío esta hecho casero con  una aguja de hipodérmica de las gruesas, con el dremel le rebajé la cánula hasta dejarla media caña (ver foto), tiene un tamaño de 0.7 cm, por cada tira de 2 cm de ancho largo dos siembras de la misma muestra, una para eluir y la otra para presentar en el informe

 

Reactivos

 

Tiras de cellogel se compran en lugares donde venden insumos para laboratorios de análisis clínicos, vienen en sobres que contiene un líquido, una vez abiertas deben conservarse en un frasco con metanol al 40%, si se secan no sirven más.

 

Buffer: hay muchas fórmulas, la que yo uso es la de veronal sódico al 0.04M,

Veronal sódico         8.24gr

Agua desestilada csp 1000 ml de solución

Conviene preparar menos, el buffer se puede usar muchas veces, una vez hecha la corrida se guarda en un frasco bien tapado para la próxima, el único problema es que puede contaminarse con hongos.

 

Liquido colorante Esta solución también puede usarse muchas veces, una vez coloreada la corrida se guarda en un frasco bien tapado

Negro amido 10B        0.5 gr

Metanol                       45 ml

Ac Acético                  10 ml

Agua                            45 ml

 

Liquido decolorante

Metanol                        47.5 ml

Ac Acético                     5 ml

Agua                             47.5 ml

 

Solución transparentizadora:

Metanol                        85 ml

Acético                         14 ml

Glicerina                         1 ml

 

Liquido para eluir

Acetico al  80%

 

Método

Se toma una tira de cellogel y se la seca entre dos papeles tipo tissue, luego se la coloca en un recipiente que tenga buffer, se la deja durante unos 10 minutos, transcurridos, se la saca y se absorbe el exceso con papel tissue, se la monta sobre el puente de la cuba con la cara opaca hacia arriba, las tiras vienen con un corte en chanfle en una de sus esquinas, ese chanfle debe estar al lado derecho del operador.

La siembra se hace a 1,5 cm del cátodo, con el aplicador antes descrito. Conviene ser rápido en todo esto para evitar que se evapore el líquido del acetato y se reseque

En la cuba se coloca en ambos compartimentos una buena cantidad de buffer. Y se pone el puente con la tira.

Se enciende la fuente, si es regulable se le da unos 150v y la corriente andará mas o menos a 1 mA por cada cm de ancho de la tira, en mi caso uso tiras de 2 cm.

Se deja 50 minutos. Si se quiere visualizar por donde anda la corrida al suero puede agregarsele una tintura (azúl de bromofenol en alcohol al 1%)

Transcurrido el tiempo se desconecta la fuente de la red y se saca la tira, ojo si se manipula, las manos deben estar bien limpias y desengrasadas. Se traslada la tira cortándole ambos extremos (dejamos solo la parte donde se encuentra el suero ya fraccionado) a un recipiente con el líquido colorante por unos 4 minutos, luego se trasvasa el liquido a su frasco y la tira puede lavarse con agua de la canilla, se la pasa luego a un recipiente con liquido decolorante, agitándola y haciendo sucesivos lavados hasta que quede el fondo completamente blanco, en este momento ya se visualizan perfectamente las fracciones, pero falta transparentizar

Antes de pasar al líquido trasparentizador conviene por 1 minuto colocar en metanol puro, luego se pasa al líquido trasparentizador por 2 minutos, una vez hecho esto, se saca con precaución la tira y se la coloca sobre un vidrio cuidando que no queden burbujas de aire, se pone sobre alguna superficie caliente, puede ser el calor de una lámpara eléctrica, (yo lo hago directamente sobre la llama, pero ojo porque puede prenderse y chau trabajo, hay que empezar de nuevo). Una vez que se le aplica calor la tira se pone transparente se la deja secar y ya tenemos nuestra corrida electroforética.

 

 

Interpretación

De total de las proteínas humanas cuyo valor normal en suero es de 6 a 8 gr/dl los porcentajes de las fracciones corresponden a:

Fracciones	Valores de referencia %	Valores de referencia g/dl
Albúmina	48,4 – 66,1	3,39-4,63
Alfa 1	2,6 – 6,3	0,18 – 0,44
Alfa 2	7,1 – 13,6	0,50 – 0.95
Beta	7,5 – 14,3	0,52 – 1,00
Gama	8,7 – 23,7	0,61 – 1,66

 

Para realizar el cálculo porcentual de las distintas fracciones se puede hacer con un densitómetro, pero también se puede hacer por elusión que es lo que voy a explicar a continuación.

Se corta la corrida de acuerdo a las líneas que he marcado, digamos en los valles:

 

Se preparan 6 tubos de ensayo numerados del 1 al 6 al primero se le agregan 10 ml de acético al 80% y a cada uno de los restantes 5 ml, el corte nro 1 se coloca en el primer tubo el 2 en el segundo y asi hasta el quinto, al último tubo  se le agrega un trozo de tira como la nro 6, que se usará de blanco. Se agita hasta que los trocitos se hayan disuelto

Para cuantificar se necesita un espectrofotómetro, se pone a cero con el tubo 6 y se leen las densidades ópticas de cada tubo a 620 nm, se anota cada valor, al primer tubo se lo multiplica por dos (tiene el doble de eluyente) se suman todos los valores, ese valor corresponde al 100% luego regla de 3 simple se calculan los porcentajes de las distintas fracciones.

 

Síntesis del proceso

 

1. Colocar el cellogel 10 minutos en buffer
   
2. Llenar la cuba con buffer
   
3. Hacer la siembra del suero del lado opaco de la tira a 1.5 cm del lado negativo de la cuba
   
4. Por 50 minutos dar 150v
   
5. Colocar en liquido colorante 4 minutos
   
6. Lavar con agua de la canilla
   
7. Decolorar con liquido decolorante
   
8. Pasar a metílico por 1 minuto
   
9. Colocar en solución transparentizadora 2 minutos
   
10. Colocar en un vidrio sobre alguna superficie caliente hasta total transparencia
    
11. Dejar secar y eluir si se desea

 

Avisos y advertencias

 

1.  El alcohol metílico es muy venenoso, se absorbe por piel y mucosas asi que trabajar con guantes y ni  se les ocurra darse un traguito, porque pasan derecho al hospital, lo bueno es que para curarlos de la intoxicación con metílico se les da vodka, whisky  o alguna otra bebida blanca, para que el etílico compita con el metílico, ya ven que no todos los remedios son horribles je je

 

2.  No meter las manos en la cuba cuando esta enchufada a la red, si la fuente tiene miliamperímetro fijarse que este en cero antes de tocar.

 

3. Los materiales como sueros o plasmas si no sabemos bien su procedencia pueden tener enfermedades muy peligrosas HIV, hepatitis A, B, C o D etc conviene ser muy cauteloso en su manejo